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华中农业大学发表水稻耐盐抗旱新调控因子
人阅读 发布时间：2018-11-08 17:12
基本信息
题目：Phosphatidylinositol-hydrolyzing phospholipase C4 modulates rice response to salt and drought
期刊：Plant Cell & Environment
影响因子：5.415
合作单位：华中农业大学
ABclonal 合作技术：OsPLC4 蛋白表达及抗体定制
ABclonal 致力于抗体与蛋白的研发，从成立之初，不断优化与调整抗体定制方案，经过多年发展，已拥有优秀的抗体制备技术人员、完善的抗体制备设施、先进的抗体制备技术，为高等院校、科研院所（如斯坦福、麻省理工、清华、北大、武大、华农，中科院生化所等）和医院机构以及医药企业（如 Novartis、Genetek、华大基因、诺禾致源、思路迪、迈新等）提供高质量的抗体定制服务。
ABclonal 抗体定制最大特色：真正的“真”保证型抗体，即请客户参与到抗体的验证中来，客户验证成功，收取尾款发大样！
优势平台
鼠单抗平台：现在可以承接 ELISA 筛选鼠单抗、WB 筛选鼠单抗、IHC/IF 筛选鼠单抗、修饰性鼠单抗、ELISA 抗体对（鼠单抗-单抗、鼠单抗-兔多抗）等不同应用的抗体定制。同时，还可以承接中和抗体等功能性抗体； IHC 靶点抗体等病理诊断抗体，免疫诊断类抗体和点突变类抗体定制服务。
兔单抗平台：第四代重组兔单抗采用创新的细胞分选与富集，生物信息学，和重组单克隆抗体技术，直接从 B 细胞中获得理想的兔单克隆抗体。
目前为止，在已经完成的项目中，客户验证通过的总成功率在 70% 以上，客户发表的文献高达几百余篇，其中顶级期刊有 Nature、Cell 等（往期 nature，cell 文献推文链接）。
优势平台（往期推文）
小编不由得感叹，好学生+好平台=好文章。下面我们一起欣赏下这篇SCI吧！
研究背景
磷脂酰肌醇特异性磷脂酶 C（PI-PLC）参与胁迫信号传导，但其信号传导功能在作物植物中仍然未知。本论文旨在研究来自水稻（Oryza sativa cv）的 PI-PLC4，OsPLC4 在渗透胁迫中发挥的积极作用。与野生型（WT）相比，两个独立敲除突变体 plc4-1 和 plc4-2 幼苗生长和存活率下降，而过表达 OsPLC4 则提高了高盐度和缺水条件下的存活率。 OsPLC4 水解磷脂酰肌醇（PI），磷脂酰肌醇4-磷酸（PI4P）和磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）在体外产生二酰基甘油（DAG），敲除 OsPLC4 会减弱盐诱导的磷脂酸（PA）的增加，而过表达 OsPLC4 会降低了盐处理下PI4P和PIP2的水平。 DAG或PA可以恢复plc4-1对WT的生长缺陷，但DAG激酶抑制剂1（DGKI1）在盐胁迫下阻断了 plc4-1 中DAG 的互补作用。此外，OsPLC4 的缺失影响肌醇三磷酸（IP3）和游离细胞质 Ca2+（[Ca2+] cyt）的增加，并且会抑制参与 Ca2+ 传感器和渗透胁迫对盐胁迫响应的基因的诱导。结果表明，OsPLC4 调节两种信号通路 PA 和 Ca2+ 的活性，影响水稻幼苗对渗透胁迫的反应。
研究结果
1. OsPLC4 具有PI-PLC 的催化活性功能
水稻基因组中鉴定出 4 种 ospic - plcs，OsPLC1, OsPLC2, OsPLC3和OsPLC4。所有的水稻 PLCs 都包含 PI-PLC-X、PI-PLC-Y 和 C2 结构域。X和Y结构域共同构成催化位点，而C2 结构域是 Ca2+ 依赖的膜靶向模块，存在于许多涉及信号转导或膜转运的细胞蛋白中。OspI - PLCs 中的 N 端序列保守性比动物的小，水稻中有 4 种 PLCs 的同源性较拟南芥的 PLCs 低，OsPLC1、OsPLC2 和 OsPLC3 的序列相似性高于 OsPLC4。
为了确定 OsPLC4 是否对活性 PI-PLC 进行水解，在大肠杆菌的N端融合 6-His 标记，表达并纯化了重组蛋白 OsPLC4，并以空载体转化大肠杆菌作为对照。OsPLC4 的全长开放阅读框由 1797 对碱基对组成，翻译成 599 个氨基酸，预测蛋白大小 67.0kDa，观察到约 73kDa 的融合蛋白(His-OsPLC4)靶带(图A)。osplc4 水解 PI、PI4P、PIP2 生成DAG，对 PIP2、PI4P 的水解活性高于 PI (图 B)。OsPLC4 水解 PI 需要 Ca2+，最大活性约为 50 mM Ca2+(图 C)。OsPLC4 的最佳 pH 值在 6.5 - 7.5之间(图 D)。
2. OsPLC4与微体膜有关，并且由高渗透引起
为了评估 OsPLC4 的亚细胞定位，在 OsPLC4 C 端与绿色荧光蛋白 (GFP) 融合，并在烟草 (Nicotiana benthamiana) 叶片中瞬时表达 (图 A)。荧光共聚焦观察 GFP 信号与内质网标记蛋白 (CFP) 结合的蓝荧光蛋白 (CFP) 共定位 (图 A)。ER 标记物是在 CFP 的 N 端和 ER 的 C 端保留信号 His-Asp-Glu-Leu 结合 AtWAK2(一种与细胞壁相关的激酶 2); 此外，研究者还从烟叶中分离出细胞黏液和微粒体部分，并瞬时表达 OsPLC4-GFP。OsPLC4-GFP 只与微体部分有关 (图 B)。当微体部分通过两相分块进一步分离时，OsPLC4-GFP 与微体部分和质膜部分均相关 (图 B)。
研究者采用实时定量聚合酶链反应 (qRT-PCR) 对水稻幼苗不同发育阶段组织的 RNA 进行定量分析，确定了 OsPLC4 的表达模式。在营养生长过程中，根和叶中 OsPLC4 转录物水平增加，分蘖期达到最高水平，而成熟叶片中 OsPLC4 转录物水平下降 (图 A)。盐胁迫上调了 OsPLC4 的表达 (图 B 和 C)。在 180 mM NaCl 中处理 5 小时后，OsPLC4 的转录水平增加了大约 60 倍，而在脱水压力下转录水平增加了 4 倍。研究者还检测了其他三个 osplc 和 OsPLC4 的转录水平，结果显示盐诱导转录水平最高 (图 3B 和 3C); 与 OsPLC4 转录水平一致，高盐坏境 2-3 天后，脱水环境中 1-3 天后，OsPLC4 的表达增加 (图 D 和 E)。转基因植物表达β-glucuronidase 是由 OsPLC4 启动子驱动的。萌发种子、幼苗和花器官的 GUS 染色显示幼苗叶片和根尖、外膜维管组织和花期花粉中有较强的 OsPLC4 表达 (图 F)。测定 POsPLC4:GUS 转基因水稻植株叶片和根系中 GUS 的活性时发现 180 mM NaCl 或脱水处理会增加 GUS 的活性 (图 G)。
3. 在 NaCl 处理下，OsPLC4 会影响 DAG、PA 和 PIs 的细胞水平
OsPLC4 水解 PI 和 PIs 生成可磷酸化 PA 的 DAG, DAG 和 PA 均参与高渗透应激反应。研究者对 WT1、plc4-1 和 OE8 叶片中 DAG、PA 和 PIs 的含量进行了测量，发现 WT1、plc4-1 和 OE8 叶片中有高盐环境和无盐坏境的 DAG 总含量相近 (A)，水稻叶片中的 DAG 类分子主要有 34:3 和 34:2DAG，其次是 36:4 和 36:5DAG。在盐胁迫下，WT1 和 plc4-1 中 DAG 的含量相近，而 OE8 中 36:1 和 36:3 DAG 类的含量明显低于 WT1。
4. 补充 DAG 或 PA 可以恢复 plc4-1 在盐胁迫下对 WT 的敏感性
为了验证 DAG 或 PA 在盐胁迫下是否能恢复 plc4-1 的敏感性，研究者在含有 NaCI 的培养基中加入了中链脂肪酸和长链脂肪酸的 DAG 或 PA。使用中链 8 碳 DAG 和 PA 的原因是它们在生长介质中比长链酰基脂类更容易分散。在不含有 DAG 或 PA 的情况下，NaCl 处理的 plc4-1 幼苗鲜重明显低于 WT1(图 B)。而在 DAG 或 PA 的存在下，plc4-1 幼苗鲜重与 WT1 相当 (图 B)。因此，无论是中链 DAG 还是 PA 的外源施用都可以使 plc4-1 在盐胁迫下恢复到 WT。
Gomez-Merino 等人发现植物中的 DAG 可以被 DAG 激酶 (DGK) 磷酸化成 PA ，为了验证 DAG 效应是否由其转化为 PA 而产生，在生长培养基中加入 DAG 激酶抑制剂 1 (DGKI1) 来阻止 DAG 转化为 PA。DAG 处理下，WT1、plc4-1 和 OE8 幼苗鲜重基本相同 (图 D)。然而，当 DGKI1 和 DAG 同时存在于培养基中时，在盐胁迫下，plc4-1 生物量明显低于 WT1(图 D)。结果表明，DGKI1 抑制盐胁迫下 DAG 对 plc4-1 生长的恢复，提示 OsPLC4 衍生的 DAG 转化为 PA, PI-PLC-DAGK 通路参与渗透应激反应。
5. OsPLC4 在盐胁迫下调节 IP3 和 Ca2+ 的变化
除了脂质产物 DAG 外，PIP2 的 OsPLC4 水解生成水溶性 IP3。研究者监测 WT1 和 plc4-1 叶片中 IP3 的含量，观察 OsPLC4 在渗透胁迫下对 IP3 形成的影响。在盐处理后的前 30 分钟内，IP3 水平升高，随后 WT1 和 plc4-1 均逐渐下降 (图 A)，WT 中 IP3 的增加幅度大于 plc4-1。在盐处理 15 和 30 分钟后，WT1 的 IP3 水平分别增加了 3.8 倍和 4.8 倍，而 plc4-1 的 IP3 水平分别增加了 1.7 倍和 2.7 倍 (图 A)。为了研究 OsPLC4 对 Ca2+ cyt 信号在渗透胁迫下的作用，通过盐处理分析了Ca2+ cyt 在 WT1 和 plc4-1 中的作用。加入 150 Mm NaCl 后，WT1 中 Ca2+ cyt 信号在 3 分钟内增加了 70%，而 plc4-1 中 Ca2+ cyt 增加了 33%(图 B)。这些结果表明，水稻幼苗中缺乏 OsPLC4 干扰了 IP3 和 Ca2+ cyt 对 NaCl 反应的动态增加。
6. 在盐胁迫处理前后，plc4-1 应激相关基因发生改变
研究者监测了编码 Ca2+ 依赖应激相关蛋白的基因的表达，包括编码 Ca2+ 依赖应激相关蛋白 calmodulin 1 (CaM1)、calmodulin 样蛋白 1 (CML1)、多应激反应基因 2 (MSR2) 和 Ca2+依赖蛋白激酶 7 (CDPK7) 的基因。与 WT1 相比，plc4-1 叶片 Ca2+ 依赖的 CaM1 和 CML1 的基础转录水平较低，但应激反应基因过氧化物酶 8.1 (POX8.1)、脱水 in (Rab16d) 和后期胚胎发生丰富蛋白 3 (LEA3) 的水平较高。plc4-1 中这些应激反应基因水平越高，意味着突变植株即使在正常生长条件下也会经历本构压力。所有这些基因在 WT1 和 plc4-1 中都受到 NaCl 胁迫的显著诱导，特别是在 NaCl 处理后的 8 小时，但这些基因在 plc4-1 中的诱导水平均低于 WT1。与正常情况相比，MSR3 中 plc4-1 的相对诱导水平约为 12 倍，盐敏感的 3 倍/钙调神经磷酸酶 B 样蛋白 4（SOS3/CBL4）2 倍，RAB16D 2 倍，LeA3 53 倍；在 150 mM NaCl 处理 8 小时后，WT1 的诱导水平是 MSR3 的 32 倍，SOS3 的 5 倍，Rab16d 的 11 倍，LEA3 的 286 倍。
文章小结
PI-PLC在动物细胞中通过产生DAG和IP3这两种有效的信使在细胞信号转导中发挥重要作用，但是DAG和IP3在植物中的功能仍然很模糊。本研究表明OsPLC4的表达是由NaCl和脱水诱导的，并且OsPLC4是介导水稻对盐胁迫和干旱胁迫响应的信号网络的一部分。为了探讨OsPLC4如何介导植物对干旱和盐胁迫的反应，我们分析了OsPLC4、DAG和IP3及其相关信号分子的直接产物。研究结果显示WT1和PLC4-1和OE8在盐胁迫下总DAG含量无明显变化，缺乏差异可能是由于用于脂质生物合成的DAG的高代谢池和/或DAG快速转化为其他脂质介质，如盐胁迫下的PA。在盐处理过程中，plc4-1对PA的升高幅度小于WT1，而OE8对PA的升高幅度大于WT1。此外，DGK抑制剂的应用消除了DAG对恢复PLC4-1应答WT1的影响。而在渗透胁迫下，PLC4-KO和过表达对生长的相反影响是由DAG向PA的转化而不是DAG本身引起。
解析文献
Phosphatidylinositol-hydrolyzing phospholipase C4 modulates rice response to salt and drought
参考文献
1. Behera, S., Wang, N., Zhang, C., Schmitz-Thom, I., Strohkamp, S., Schültke, S., Hashimoto, K., Xiong, L., and Kudla, J.(2015). Analyses of Ca2+dynamics using a ubiquitin-10 promoter-driven Yellow Cameleon 3.6 indicator reveal reliable transgene expression and differences in cytoplasmic Ca2+responses in Arabidopsis and rice (Oryza sativa) roots. New Phytologist 206, 751-760.
2. Boudsocq, M., and Lauriere, C. (2005). Osmotic signaling in plants: multiple pathways mediated by emerging kinase families. Plant physiology 138, 1185-1194.
3. Cao, H., Zhuo, L., Su, Y., Sun, L., and Wang, X. (2016). Non-specific phospholipase C1 affects silicon distribution and mechanical strength in stem nodes of rice. Plant Journal. 86, 308-821.
4. Cho, W., and Stahelin, R.V. (2006). Membrane binding and subcellular targeting of C2 domains. Biochimica et Biophysica Acta 1761, 838-849.
5. Drøbak, B.K., Brewin, N.J., and Hernandez, L.E. (2000). Extraction, separation, and analysis of plant phosphoinositides and complex glycolipids. In Plant Hormone Protocols, G.A. Tucker and J.A. Roberts, eds (Totowa, NJ: Humana Press), pp. 157-174.
6. Georges, F., Das, S., Ray, H., Bock, C., Nokhrina, K., Kolla, V.A., and Keller, W. (2009). Over-expression of Brassica napus phosphatidylinositol-phospholipase C2 in canola induces significant changes in gene expression and phytohormone distribution patterns, enhances drought tolerance and promotes early flowering and maturation. Plant, Cell & Environment 32,1664-1681.
7. Gomez-Merino, F.C., Arana-Ceballos, F.A., Trejo-Tellez, L.I., Skirycz, A., Brearley, C.A., Dormann, P., and Mueller-Roeber, B. (2005). Arabidopsis AtDGK7, the smallest member of plant diacylglycerol kinases (DGKs), displays unique biochemical features and saturates at low substrate concentration: the DGK inhibitor R59022 differentially affects AtDGK2 and AtDGK7 activity in vitro and alters plant growth and development. Journal of Biological Chemistry 280, 34888-34899.
题目：Phosphatidylinositol-hydrolyzing phospholipase C4 modulates rice response to salt and drought
期刊：Plant Cell & Environment
影响因子：5.415
合作单位：华中农业大学
ABclonal 合作技术：OsPLC4 蛋白表达及抗体定制
ABclonal 致力于抗体与蛋白的研发，从成立之初，不断优化与调整抗体定制方案，经过多年发展，已拥有优秀的抗体制备技术人员、完善的抗体制备设施、先进的抗体制备技术，为高等院校、科研院所（如斯坦福、麻省理工、清华、北大、武大、华农，中科院生化所等）和医院机构以及医药企业（如 Novartis、Genetek、华大基因、诺禾致源、思路迪、迈新等）提供高质量的抗体定制服务。
ABclonal 抗体定制最大特色：真正的“真”保证型抗体，即请客户参与到抗体的验证中来，客户验证成功，收取尾款发大样！
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鼠单抗平台：现在可以承接 ELISA 筛选鼠单抗、WB 筛选鼠单抗、IHC/IF 筛选鼠单抗、修饰性鼠单抗、ELISA 抗体对（鼠单抗-单抗、鼠单抗-兔多抗）等不同应用的抗体定制。同时，还可以承接中和抗体等功能性抗体； IHC 靶点抗体等病理诊断抗体，免疫诊断类抗体和点突变类抗体定制服务。
兔单抗平台：第四代重组兔单抗采用创新的细胞分选与富集，生物信息学，和重组单克隆抗体技术，直接从 B 细胞中获得理想的兔单克隆抗体。
目前为止，在已经完成的项目中，客户验证通过的总成功率在 70% 以上，客户发表的文献高达几百余篇，其中顶级期刊有 Nature、Cell 等（往期 nature，cell 文献推文链接）。
优势平台（往期推文）
小编不由得感叹，好学生+好平台=好文章。下面我们一起欣赏下这篇SCI吧！
研究背景
磷脂酰肌醇特异性磷脂酶 C（PI-PLC）参与胁迫信号传导，但其信号传导功能在作物植物中仍然未知。本论文旨在研究来自水稻（Oryza sativa cv）的 PI-PLC4，OsPLC4 在渗透胁迫中发挥的积极作用。与野生型（WT）相比，两个独立敲除突变体 plc4-1 和 plc4-2 幼苗生长和存活率下降，而过表达 OsPLC4 则提高了高盐度和缺水条件下的存活率。 OsPLC4 水解磷脂酰肌醇（PI），磷脂酰肌醇4-磷酸（PI4P）和磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）在体外产生二酰基甘油（DAG），敲除 OsPLC4 会减弱盐诱导的磷脂酸（PA）的增加，而过表达 OsPLC4 会降低了盐处理下PI4P和PIP2的水平。 DAG或PA可以恢复plc4-1对WT的生长缺陷，但DAG激酶抑制剂1（DGKI1）在盐胁迫下阻断了 plc4-1 中DAG 的互补作用。此外，OsPLC4 的缺失影响肌醇三磷酸（IP3）和游离细胞质 Ca2+（[Ca2+] cyt）的增加，并且会抑制参与 Ca2+ 传感器和渗透胁迫对盐胁迫响应的基因的诱导。结果表明，OsPLC4 调节两种信号通路 PA 和 Ca2+ 的活性，影响水稻幼苗对渗透胁迫的反应。
研究结果
1. OsPLC4 具有PI-PLC 的催化活性功能
水稻基因组中鉴定出 4 种 ospic - plcs，OsPLC1, OsPLC2, OsPLC3和OsPLC4。所有的水稻 PLCs 都包含 PI-PLC-X、PI-PLC-Y 和 C2 结构域。X和Y结构域共同构成催化位点，而C2 结构域是 Ca2+ 依赖的膜靶向模块，存在于许多涉及信号转导或膜转运的细胞蛋白中。OspI - PLCs 中的 N 端序列保守性比动物的小，水稻中有 4 种 PLCs 的同源性较拟南芥的 PLCs 低，OsPLC1、OsPLC2 和 OsPLC3 的序列相似性高于 OsPLC4。
为了确定 OsPLC4 是否对活性 PI-PLC 进行水解，在大肠杆菌的N端融合 6-His 标记，表达并纯化了重组蛋白 OsPLC4，并以空载体转化大肠杆菌作为对照。OsPLC4 的全长开放阅读框由 1797 对碱基对组成，翻译成 599 个氨基酸，预测蛋白大小 67.0kDa，观察到约 73kDa 的融合蛋白(His-OsPLC4)靶带(图A)。osplc4 水解 PI、PI4P、PIP2 生成DAG，对 PIP2、PI4P 的水解活性高于 PI (图 B)。OsPLC4 水解 PI 需要 Ca2+，最大活性约为 50 mM Ca2+(图 C)。OsPLC4 的最佳 pH 值在 6.5 - 7.5之间(图 D)。
2. OsPLC4与微体膜有关，并且由高渗透引起
为了评估 OsPLC4 的亚细胞定位，在 OsPLC4 C 端与绿色荧光蛋白 (GFP) 融合，并在烟草 (Nicotiana benthamiana) 叶片中瞬时表达 (图 A)。荧光共聚焦观察 GFP 信号与内质网标记蛋白 (CFP) 结合的蓝荧光蛋白 (CFP) 共定位 (图 A)。ER 标记物是在 CFP 的 N 端和 ER 的 C 端保留信号 His-Asp-Glu-Leu 结合 AtWAK2(一种与细胞壁相关的激酶 2); 此外，研究者还从烟叶中分离出细胞黏液和微粒体部分，并瞬时表达 OsPLC4-GFP。OsPLC4-GFP 只与微体部分有关 (图 B)。当微体部分通过两相分块进一步分离时，OsPLC4-GFP 与微体部分和质膜部分均相关 (图 B)。
研究者采用实时定量聚合酶链反应 (qRT-PCR) 对水稻幼苗不同发育阶段组织的 RNA 进行定量分析，确定了 OsPLC4 的表达模式。在营养生长过程中，根和叶中 OsPLC4 转录物水平增加，分蘖期达到最高水平，而成熟叶片中 OsPLC4 转录物水平下降 (图 A)。盐胁迫上调了 OsPLC4 的表达 (图 B 和 C)。在 180 mM NaCl 中处理 5 小时后，OsPLC4 的转录水平增加了大约 60 倍，而在脱水压力下转录水平增加了 4 倍。研究者还检测了其他三个 osplc 和 OsPLC4 的转录水平，结果显示盐诱导转录水平最高 (图 3B 和 3C); 与 OsPLC4 转录水平一致，高盐坏境 2-3 天后，脱水环境中 1-3 天后，OsPLC4 的表达增加 (图 D 和 E)。转基因植物表达β-glucuronidase 是由 OsPLC4 启动子驱动的。萌发种子、幼苗和花器官的 GUS 染色显示幼苗叶片和根尖、外膜维管组织和花期花粉中有较强的 OsPLC4 表达 (图 F)。测定 POsPLC4:GUS 转基因水稻植株叶片和根系中 GUS 的活性时发现 180 mM NaCl 或脱水处理会增加 GUS 的活性 (图 G)。
3. 在 NaCl 处理下，OsPLC4 会影响 DAG、PA 和 PIs 的细胞水平
OsPLC4 水解 PI 和 PIs 生成可磷酸化 PA 的 DAG, DAG 和 PA 均参与高渗透应激反应。研究者对 WT1、plc4-1 和 OE8 叶片中 DAG、PA 和 PIs 的含量进行了测量，发现 WT1、plc4-1 和 OE8 叶片中有高盐环境和无盐坏境的 DAG 总含量相近 (A)，水稻叶片中的 DAG 类分子主要有 34:3 和 34:2DAG，其次是 36:4 和 36:5DAG。在盐胁迫下，WT1 和 plc4-1 中 DAG 的含量相近，而 OE8 中 36:1 和 36:3 DAG 类的含量明显低于 WT1。
4. 补充 DAG 或 PA 可以恢复 plc4-1 在盐胁迫下对 WT 的敏感性
为了验证 DAG 或 PA 在盐胁迫下是否能恢复 plc4-1 的敏感性，研究者在含有 NaCI 的培养基中加入了中链脂肪酸和长链脂肪酸的 DAG 或 PA。使用中链 8 碳 DAG 和 PA 的原因是它们在生长介质中比长链酰基脂类更容易分散。在不含有 DAG 或 PA 的情况下，NaCl 处理的 plc4-1 幼苗鲜重明显低于 WT1(图 B)。而在 DAG 或 PA 的存在下，plc4-1 幼苗鲜重与 WT1 相当 (图 B)。因此，无论是中链 DAG 还是 PA 的外源施用都可以使 plc4-1 在盐胁迫下恢复到 WT。
Gomez-Merino 等人发现植物中的 DAG 可以被 DAG 激酶 (DGK) 磷酸化成 PA ，为了验证 DAG 效应是否由其转化为 PA 而产生，在生长培养基中加入 DAG 激酶抑制剂 1 (DGKI1) 来阻止 DAG 转化为 PA。DAG 处理下，WT1、plc4-1 和 OE8 幼苗鲜重基本相同 (图 D)。然而，当 DGKI1 和 DAG 同时存在于培养基中时，在盐胁迫下，plc4-1 生物量明显低于 WT1(图 D)。结果表明，DGKI1 抑制盐胁迫下 DAG 对 plc4-1 生长的恢复，提示 OsPLC4 衍生的 DAG 转化为 PA, PI-PLC-DAGK 通路参与渗透应激反应。
5. OsPLC4 在盐胁迫下调节 IP3 和 Ca2+ 的变化
除了脂质产物 DAG 外，PIP2 的 OsPLC4 水解生成水溶性 IP3。研究者监测 WT1 和 plc4-1 叶片中 IP3 的含量，观察 OsPLC4 在渗透胁迫下对 IP3 形成的影响。在盐处理后的前 30 分钟内，IP3 水平升高，随后 WT1 和 plc4-1 均逐渐下降 (图 A)，WT 中 IP3 的增加幅度大于 plc4-1。在盐处理 15 和 30 分钟后，WT1 的 IP3 水平分别增加了 3.8 倍和 4.8 倍，而 plc4-1 的 IP3 水平分别增加了 1.7 倍和 2.7 倍 (图 A)。为了研究 OsPLC4 对 Ca2+ cyt 信号在渗透胁迫下的作用，通过盐处理分析了Ca2+ cyt 在 WT1 和 plc4-1 中的作用。加入 150 Mm NaCl 后，WT1 中 Ca2+ cyt 信号在 3 分钟内增加了 70%，而 plc4-1 中 Ca2+ cyt 增加了 33%(图 B)。这些结果表明，水稻幼苗中缺乏 OsPLC4 干扰了 IP3 和 Ca2+ cyt 对 NaCl 反应的动态增加。
6. 在盐胁迫处理前后，plc4-1 应激相关基因发生改变
研究者监测了编码 Ca2+ 依赖应激相关蛋白的基因的表达，包括编码 Ca2+ 依赖应激相关蛋白 calmodulin 1 (CaM1)、calmodulin 样蛋白 1 (CML1)、多应激反应基因 2 (MSR2) 和 Ca2+依赖蛋白激酶 7 (CDPK7) 的基因。与 WT1 相比，plc4-1 叶片 Ca2+ 依赖的 CaM1 和 CML1 的基础转录水平较低，但应激反应基因过氧化物酶 8.1 (POX8.1)、脱水 in (Rab16d) 和后期胚胎发生丰富蛋白 3 (LEA3) 的水平较高。plc4-1 中这些应激反应基因水平越高，意味着突变植株即使在正常生长条件下也会经历本构压力。所有这些基因在 WT1 和 plc4-1 中都受到 NaCl 胁迫的显著诱导，特别是在 NaCl 处理后的 8 小时，但这些基因在 plc4-1 中的诱导水平均低于 WT1。与正常情况相比，MSR3 中 plc4-1 的相对诱导水平约为 12 倍，盐敏感的 3 倍/钙调神经磷酸酶 B 样蛋白 4（SOS3/CBL4）2 倍，RAB16D 2 倍，LeA3 53 倍；在 150 mM NaCl 处理 8 小时后，WT1 的诱导水平是 MSR3 的 32 倍，SOS3 的 5 倍，Rab16d 的 11 倍，LEA3 的 286 倍。
文章小结
PI-PLC在动物细胞中通过产生DAG和IP3这两种有效的信使在细胞信号转导中发挥重要作用，但是DAG和IP3在植物中的功能仍然很模糊。本研究表明OsPLC4的表达是由NaCl和脱水诱导的，并且OsPLC4是介导水稻对盐胁迫和干旱胁迫响应的信号网络的一部分。为了探讨OsPLC4如何介导植物对干旱和盐胁迫的反应，我们分析了OsPLC4、DAG和IP3及其相关信号分子的直接产物。研究结果显示WT1和PLC4-1和OE8在盐胁迫下总DAG含量无明显变化，缺乏差异可能是由于用于脂质生物合成的DAG的高代谢池和/或DAG快速转化为其他脂质介质，如盐胁迫下的PA。在盐处理过程中，plc4-1对PA的升高幅度小于WT1，而OE8对PA的升高幅度大于WT1。此外，DGK抑制剂的应用消除了DAG对恢复PLC4-1应答WT1的影响。而在渗透胁迫下，PLC4-KO和过表达对生长的相反影响是由DAG向PA的转化而不是DAG本身引起。
解析文献
Phosphatidylinositol-hydrolyzing phospholipase C4 modulates rice response to salt and drought
参考文献
1. Behera, S., Wang, N., Zhang, C., Schmitz-Thom, I., Strohkamp, S., Schültke, S., Hashimoto, K., Xiong, L., and Kudla, J.(2015). Analyses of Ca2+dynamics using a ubiquitin-10 promoter-driven Yellow Cameleon 3.6 indicator reveal reliable transgene expression and differences in cytoplasmic Ca2+responses in Arabidopsis and rice (Oryza sativa) roots. New Phytologist 206, 751-760.
2. Boudsocq, M., and Lauriere, C. (2005). Osmotic signaling in plants: multiple pathways mediated by emerging kinase families. Plant physiology 138, 1185-1194.
3. Cao, H., Zhuo, L., Su, Y., Sun, L., and Wang, X. (2016). Non-specific phospholipase C1 affects silicon distribution and mechanical strength in stem nodes of rice. Plant Journal. 86, 308-821.
4. Cho, W., and Stahelin, R.V. (2006). Membrane binding and subcellular targeting of C2 domains. Biochimica et Biophysica Acta 1761, 838-849.
5. Drøbak, B.K., Brewin, N.J., and Hernandez, L.E. (2000). Extraction, separation, and analysis of plant phosphoinositides and complex glycolipids. In Plant Hormone Protocols, G.A. Tucker and J.A. Roberts, eds (Totowa, NJ: Humana Press), pp. 157-174.
6. Georges, F., Das, S., Ray, H., Bock, C., Nokhrina, K., Kolla, V.A., and Keller, W. (2009). Over-expression of Brassica napus phosphatidylinositol-phospholipase C2 in canola induces significant changes in gene expression and phytohormone distribution patterns, enhances drought tolerance and promotes early flowering and maturation. Plant, Cell & Environment 32,1664-1681.
7. Gomez-Merino, F.C., Arana-Ceballos, F.A., Trejo-Tellez, L.I., Skirycz, A., Brearley, C.A., Dormann, P., and Mueller-Roeber, B. (2005). Arabidopsis AtDGK7, the smallest member of plant diacylglycerol kinases (DGKs), displays unique biochemical features and saturates at low substrate concentration: the DGK inhibitor R59022 differentially affects AtDGK2 and AtDGK7 activity in vitro and alters plant growth and development. Journal of Biological Chemistry 280, 34888-34899.
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