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NEWS | ABclonal首席科学家惠立博士携高端抗体CRO走进赛诺菲（Sanofi）

人阅读发布时间：2018-12-04 12:24

主讲人简介<ABclonal首席科学家--惠立博士>

2017-Now ABclonal Chief Scientist

2009-2017 Cell Signaling Technology, Project Manager

2006-2009 Novartis, Postdoc

2000-2006 City University of New York PhD, Molecular Cell Biology

Dr. Hui has a decade of experience in leading antibody discovery and development projects that target key signaling pathways in Cancer cell biology, metabolism, immunology and neurodegenerative diseases. Currently she leads efforts to optimize rabbit monoclonal antibody discovery technology at ABclonal for large scale and efficient development of both customized and catalogue monoclonal antibody products.

>>>>第四代重组兔单抗技术

第四代重组兔单抗采用创新的细胞分选与富集，生物信息学，和重组单克隆抗体技术，直接从B细胞中获得理想的兔单克隆抗体。相比传统而且被广泛使用的第一代多抗技术、第二代鼠单克隆抗体技术、第三代杂交瘤兔单克隆抗体技术，ABclonal所拥有的第四代兔单克隆重组抗体技术具有更多更显著的优势。

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技术流程

>>>鼠单抗技术简介

ABclonal以4000多个标准级养殖笼位的实验动物基地为保障，凭借先进成熟的技术平台、优秀的管理团队与经验丰富的研发团队，为客户提供多种个性化抗体CRO定制服务。ABclonal可提供高质量的鼠单抗制备服务，已满足客户全方位需求。目前，鼠单抗能提供的服务内容包括：应用于WB/IHC/IF/IP的抗体制备服务、保证型抗体制备服务、ELISA配对抗体制备服务、中和功能抗体制备服务；同时，也能提供病理诊断类抗体定制、免疫诊断类抗体对定制、点突变类抗体定制。

◆ 完善的抗体评价体系：WB/IHC/IF/IP/Co-IP

◆ 全面的鼠单抗平台：小鼠单抗和大鼠单抗两个平台

◆ 专业的抗原设计团队：可以准确分析目标蛋白的一级结构，二级结构和三级结构，从而确定最佳的抗原序列。

◆ 拥有完善的上游四大表达平台：原核表达系统、昆虫表达系统，酵母表达系统和哺乳动物细胞表达系统。

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阳性克隆筛选

ELISA 筛选：

★ ELISA筛选是单抗筛选中主要的筛选手段，可以从细胞中筛选到有效的阳性克隆，但ELISA实验无法区分假阳性，需要综合其他筛选手段。

内源WB筛选：

★ 细胞融合前，会对每只小鼠血清中抗体水平进行检测，选取最佳的小鼠进行融合。

★ 细胞融合后，ABclonal采用MINI-WB筛选系统对阳性细胞株的细胞上清进行批量检测。

IHC/IF/IP芯片筛选：

★ ABclonal采用多种阳性细胞株通量制备腹水，对腹水中抗体的质量进行相关的实验检测制备鼠单克隆抗体经验，每一步都严格质控，优化，高通量全方位为客户筛选，竭诚为客户提供满意的结果。

宣讲亮点节选

--SEMINAR--

造就兔抗体优越特性的生物学机制是什么呢？

目前认为，兔有和其他哺乳动物完全不一样的B细胞库（B-cell repertoire）发育机制。现有模型认为，兔B淋巴细胞发育成熟有三个主要步骤：首先，新生B淋巴细胞库（Neonatal B-cell repertoire）：该库在胚胎的肝脏和网膜中通过B淋巴细胞增殖（B lymphopoiesis）发育而成，该发育过程一般在妊娠后的第二到第三周开始并在出生时转移到骨髓中；其次，初级B淋巴细胞库（Primary B-cell repertoire）：出生之后新生B淋巴细胞库在骨髓中进一步发育，出生后的两个月中该发育过程转移到胃肠道相关淋巴组织（gut-associated lymphoid tissue, GALT）中继续进行，从而形成初级B淋巴细胞库（又称免疫前B淋巴细胞库）；最后，次级B淋巴细胞库（Secondary B-cell repertoire）：经外源性的抗原物质刺激后，初级B淋巴细胞进一步发育成熟，形成次级B淋巴细胞库（又称免疫B淋巴细胞库）。在成年兔的骨髓中，很少有新的B淋巴细胞增殖。然而有趣的是，在成年兔的脾脏细胞中却能够发现含有胚系免疫球蛋白基因（Germline IgG gene）的B淋巴细胞；另外，在兔子的同种移植实验中发现，不同兔子之间的B细胞可以进行同种移植到干细胞微环境（Stem Cell niche）中。这些发现证明兔B淋巴细胞长寿并有潜在的自我更新能力，从而在兔子的整个生命周期中都能支撑抗体库（Antibody Repertoire）产生。

兔B细胞发育亲和力成熟

2那么，什么是第四代重组兔单抗？存在哪些优势？

总体而言，对于兔单克隆抗体的开发，从技术上主要有传统的杂交瘤融合方法、噬菌体展示技术和新兴的B细胞克隆技术等，下面主要就这三种方法做一个简单的介绍：

杂交瘤融合技术

自1975年Georges Kohler和Cesar Milstein开发了杂交瘤融合技术，并把它应用到小鼠单克隆抗体的开发上后，对现代生物医学研究产生了重大的影响。这是历史最悠久的一种单克隆抗体制备技术，其主要通过将免疫后动物体内的B淋巴细胞和骨髓瘤细胞（Myeloma Cell）相融合来永生化分泌抗体的B细胞，然后通过有限稀释方法来筛选分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，再通过对该细胞株的放大培养来大规模生产单克隆抗体。

杂交瘤细胞融合技术，在开发和制备小鼠的单克隆抗体方面应用最为广泛。由于兔单克隆抗体的优越性，从上世纪80年代开始，就有科研工作者开始致力于研发基于杂交瘤技术来制备兔单克隆抗体。但由于缺乏比较好的兔骨髓瘤细胞株来作为融合细胞株，进展一直不太顺利。因此，早期也有科研工作者尝试着使用鼠骨髓瘤细胞株，对兔B淋巴细胞进行异种融合来产生鼠-兔杂交瘤细胞株。但由于融合效率低、基因组的不稳定性和兔抗体重链轻链配对存在缺陷等原因，该方法并不是十分有效。

噬菌体展示技术

早在1985年，George Smith等发现可以通过基因工程手段改变编码噬菌体菌丝蛋白的pIII基因，使其表达不同的肽段或蛋白序列，同时不影响噬菌体的活性和感染功能。利用噬菌体展示技术来筛选单克隆抗体，早在1990年代早期就开始进行了，并通过构建编码抗体基因的噬菌体库成功筛选获得了目标抗体的scFv片段和Fab片段；目前，噬菌体展示技术仍旧被主要用来筛选scFv和Fab片段。

但是，噬菌体展示技术还存在着下列一些缺陷：

1、其依赖于噬菌体和原核细菌的表达系统，因此抗体的重链和轻链在该系统中未必都能得到正确的转录、翻译、翻译后修饰、折叠和组装。

2、噬菌体展示技术，和其他的一些展示技术（如酵母系统展示技术）一样，其获得抗体中重链和轻链的配对是随机的、人工的配对，即不能反映真实的体内天然配对的情况。

3、通过噬菌体展示技术筛选单克隆抗体，还非常依赖于库容量；只有构建大容量的抗体库进行多轮筛选，才有几率获得高亲和力的兔单克隆抗体。

4、噬菌体展示技术，对于操作人员技术能力的要求，远远高于杂交瘤融合技术；且筛选周期较长，和杂交瘤筛选相等。

除了噬菌体展示技术之外，近几年来还发展出了酵母展示技术（Yeast Display）。和噬菌体展示技术相比，在酵母中展示单克隆抗体，可以模拟与哺乳动物细胞类似的翻译后修饰工作，使表达的抗体能够呈现出相对正确的构象。其基本原理和噬菌体展示技术类似，因此也无法完全克服上述关于噬菌体展示技术的缺陷。

单细胞筛选和克隆技术

利用噬菌体展示技术来筛选兔单克隆抗体，存在上述一些缺点；而传统的杂交瘤细胞技术，仍旧存在着融合效率低、所获得杂交瘤细胞株的稳定性不高和存在着专利保护壁垒等缺陷。因此，自从2000年代早期开始，科研工作者们即致力于开发和发展独立于杂交瘤融合技术和噬菌体展示技术的、新一代兔单克隆抗体开发技术。

利用该方法进行兔单克隆抗体的开发，主要是利用B细胞表面标记物、结合多色流式细胞设备分选出特异的B淋巴细胞，然后进行单个B细胞重链和轻链基因的克隆和体外表达。该方法的优点是，和杂交瘤细胞技术相似，所获得抗体的重链和轻链的配对，完全反映体内天然的配对情况；并且可以从外周血淋巴细胞中分离B细胞，不需要处死动物即可以完成筛选。如何从单个B细胞中获取编码相应单克隆抗体重链和轻链基因，目前主要以下几种方法：

1. 单细胞直接PCR（Direct PCR from Single B cell）：从筛选获得的单个B细胞中直接PCR获取编码抗体的轻、重链基因。

2. NG-XMT™ 技术：由CST公司在2012年开发，即利用NGS技术和蛋白质组技术相结合，通过抗原蛋白从经免疫后动物外周血中富集抗体，通过质谱的方法来获取抗体的氨基酸序列信息，最后和NGS获得的基因序列信息进行比对来获取抗体的轻重链配对信息；但该方法仍有一些技术问题没有解决，并没有在推广到大规模的商业化应用。

但总的来说，利用上述方法来获得单克隆抗体，在商业化应用上面存在着以下一些劣势：

1、这些技术路线大部分需依赖于单细胞PCR技术来扩增抗体的重链和轻链，因此对操作人员的技术要求、环境要求均比较高；并且，需要较多的循环数（一般>50）或者多轮PCR才能有效扩增出抗体的重链和轻链基因，因此目标基因中存在PCR介导突变的几率增加，有可能丢失功能性抗体。

2、这些技术在获得了编码抗体的重链和轻链基因信息之后，还需要在体外进行重组表达验证，成本较高：扩增一块96孔板的B细胞抗体基因，并进行体外表达验证，其成本可高达5000-8000美元；而CST公司的NG-XMT™ 技术因需要和质谱技术联用，不但成本更加昂贵，而且在技术上要求也更加高。

3、对于兔单克隆抗体的筛选，由于针对兔B淋巴细胞表面标记物的商业化抗体仍旧不多，限制了筛选所获得兔B淋巴细胞的纯度，最终获得阳性克隆的比例较低，因此从另外一个角度也相应增加了兔单克隆抗体开发的总体成本。

4、除了上述的成本劣势之外，从单细胞中克隆抗体基因并进行体外重组表达验证，工作量大、时间长，因此，该方法不适用于大通量的筛选。

为了克服单细胞筛选和克隆技术的上述劣势，使其能够快速、便捷、大通量的筛选目标抗体，ABclonal致力于开发了不同于上述方法的B淋巴细胞单细胞分选——培养——抗体基因克隆方案，即采用优化配方后的培养基，对分选获得的单个兔B淋巴细胞进行体外培养，刺激B细胞在体外实现增殖并分泌足够量的抗体IgG用于初级筛选。众所周知，分选获得的B淋巴细胞是原代细胞，对于原代细胞的培养一直是细胞生物学研究的一个难题；而ABclonal通过多年的研究和优化，实现了对单个B淋巴细胞的体外培养，培养周期可长达数周，识别抗原的单克隆B细胞阳性率（即分泌抗体IgG的比例）可达60%，且分泌抗体的浓度平均大于1ug/ml。ABclonal将该平台称之为基于单细胞筛选和克隆的单克隆抗体筛选平台（Single Cell Based Monoclonal Antibody Discovery Platform, SMab^TM）。