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呕心之作-WB相关注意事项及新型一步法WB
人阅读 发布时间：2019-10-22 16:24
WB简单又复杂，可结果往往是别家的条带是那么的perfect，自己做的是惨不忍睹，重复到怀疑人生。别捉急，快来get这份WB宝典吧。
制样、制胶、电泳、转膜、封闭、一抗、二抗、显影，我们一步一步慢慢道来。
首先从制样说起。制样的要是能获得绝大多数目的蛋白、合适的目的蛋白和总蛋白浓度。通常植物组织液氮研磨、动物组织匀浆器研磨、细胞直接收集即可。RIPA buffer裂解后再加loading buffer 95℃煮是一种方法，直接加入loading buffer煮样后收集也是可以的。样品过于粘稠可以用超声、延长加热时间处理。tips：曾有同学抱怨使用我们组蛋白修饰的抗体试剂盒用于WB检测，信号极弱。后来得知该同学是RIPA buffer裂解细胞后离心收集上清再加入loading buffer制备样品，其实像组蛋白这类水溶性很差且与DNA结合紧密的蛋白，需要添加超声处理步骤或者直接用loading buffer收集细胞，不然损失很大哦！
直接购买预制胶的土豪可以忽略，但其他同学要记住胶要平，凝聚速度不能过快！！！
电泳时，点样顺序可得提前好好设计，空的泳道记得点上等体积的1X loading buffer。通常是恒压电泳，具体电压根据各自仪器的不同而略有差异，但不要太高哦。样品间浓度差异过大、盐浓度过高、太过粘稠、有不溶的颗粒物、胶孔不齐等是条带不过美观的主要因素，大家尽量避免啦。
接下来是转膜。在ABclonal的实验体系下，恒流（不低于200mA）转40-200min（分子量大的目的蛋白需要更更高的电流和更长的时间）能满足各种大小蛋白的实验需要。半干转虽然速度快，但效果是不如湿转的。观察预染marker、转膜后考染检测凝胶可以帮你判断转膜效果。有同学担心蛋白穿膜，0.2μm孔径的膜是你最好的归宿！tips：转膜会大量放热，注意持续保持低温；转膜槽连续使用会有大量盐在电极丝上析出，建议使用后用纯水浸泡清洗以维持正常的使用效果；细心、无气泡也是转膜的基本素质！
封闭也是必不可少的。常见的封闭剂有TBST溶解的5% 脱脂奶粉、BSA，少数抗体对某些封闭剂可能有一定背景，咨询抗体供应商选择与其一致的封闭剂吧。
一抗孵育。抗体本身的质量是WB中最最最重要的因素，这个我们单独再谈。一般4℃过夜孵育的效果会更好，采用5%的TBST-BSA稀释抗体是不错的选择。回收再使用别忘了NaN3。
二抗孵育就不多说了。注意各种标记二抗的标记物的区别，选购时要结合效价来比较每次实验的单价，这样才能买到性价比最高的二抗，ABclonal是很好的选择。批量购买的话，一定要保证批次间无差异，ABclonal相关产品出库前可是会严格质控的。
显影底物也得提一下。市面上各种底物之间的灵敏度差异真的很大!高灵敏度的底物能很好的减少一抗的使用量。
好了，操作方法介绍到这，下面我们一起来观摩一下
WB操作不当案例分析
A：封闭不完全；抗体或血清非特异结合；
B：转膜未转完全、抗体效价过低或目的蛋白丰度过低（导致信号弱、部分信号、条带不完
整），以及转膜不当造成气泡（转膜过程中，凝胶和膜没有充分贴合，出现空泡现象。检测结果中此区域的信号会较弱，影响结果判定）；
C：蛋白样本降解（蛋白样本降解后，检测到弥散或多条带）；
D：封闭液中脱脂奶粉未完全溶解，溶液中的颗粒吸附在膜表面，颗粒占据的位置就没有封闭完全，检测结果中就会出现斑斑点点。
E：样本上样量过大或抗体稀释度过小，检测结果中，条带连成一片。
F：制备凝胶不均匀（在不均匀的位置，检测的条带形状会出现变形）；部分信号淬灭（可能膜放较长时间）导致曝光不好；
G：样品浓度太高；电压不稳或凝胶在电泳过程中过热，出现条带变形；
以上为一些常见的WB问题解析，是不是有似曾相识的赶脚，希望对苦苦挣扎中的你有所帮助。
说到这似乎要结束了，不急，后面还有干货。
话说WB操作好比西天取经，一路历经艰辛，仿佛不遇到点幺蛾子，就不算做过一次WB实验。吃瓜群众不禁要问，世界在进步，科学在发展，有没有简单快捷的方式，过程越多，出错的概率就越大。
当然有，WB一步法。
常规的Western Blot检测过程（封闭，洗涤，一抗结合, 洗涤，二抗结合和洗涤）需要5-6个小时（一抗过夜需要时间更久），实验流程复杂且需要多步条件优化，使用一步法抗体可以在不减弱实验灵敏度的情况下，将封闭，洗涤，一抗结合, 洗涤，二抗结合合并为一个步骤，把实验时间锐减为2小时左右。胶上的蛋白转移到印迹膜上后，使用一抗和二抗稀释而成的抗体孵育液短时间孵育印迹膜后，经简单洗涤，即可进行发光或显色检测。
常规WB与新型一步法WB操作示意图
除了省时省力外，新型一步法快速WB实验有检测灵敏度高和背景低等多种优点。当然这些诸多优势也不是没有限制的，自然对抗体提出了更高的需求，特异型好自不必说，且效价要高，毕竟要在短时间内发生亲和反应。
一步法抗体结果展示
RK05658 [one step] HSP90AA1 Antibody Kit
RK05713 [one step] TARDBP Antibody Kit
制样、制胶、电泳、转膜、封闭、一抗、二抗、显影，我们一步一步慢慢道来。
首先从制样说起。制样的要是能获得绝大多数目的蛋白、合适的目的蛋白和总蛋白浓度。通常植物组织液氮研磨、动物组织匀浆器研磨、细胞直接收集即可。RIPA buffer裂解后再加loading buffer 95℃煮是一种方法，直接加入loading buffer煮样后收集也是可以的。样品过于粘稠可以用超声、延长加热时间处理。tips：曾有同学抱怨使用我们组蛋白修饰的抗体试剂盒用于WB检测，信号极弱。后来得知该同学是RIPA buffer裂解细胞后离心收集上清再加入loading buffer制备样品，其实像组蛋白这类水溶性很差且与DNA结合紧密的蛋白，需要添加超声处理步骤或者直接用loading buffer收集细胞，不然损失很大哦！
直接购买预制胶的土豪可以忽略，但其他同学要记住胶要平，凝聚速度不能过快！！！
电泳时，点样顺序可得提前好好设计，空的泳道记得点上等体积的1X loading buffer。通常是恒压电泳，具体电压根据各自仪器的不同而略有差异，但不要太高哦。样品间浓度差异过大、盐浓度过高、太过粘稠、有不溶的颗粒物、胶孔不齐等是条带不过美观的主要因素，大家尽量避免啦。
接下来是转膜。在ABclonal的实验体系下，恒流（不低于200mA）转40-200min（分子量大的目的蛋白需要更更高的电流和更长的时间）能满足各种大小蛋白的实验需要。半干转虽然速度快，但效果是不如湿转的。观察预染marker、转膜后考染检测凝胶可以帮你判断转膜效果。有同学担心蛋白穿膜，0.2μm孔径的膜是你最好的归宿！tips：转膜会大量放热，注意持续保持低温；转膜槽连续使用会有大量盐在电极丝上析出，建议使用后用纯水浸泡清洗以维持正常的使用效果；细心、无气泡也是转膜的基本素质！
封闭也是必不可少的。常见的封闭剂有TBST溶解的5% 脱脂奶粉、BSA，少数抗体对某些封闭剂可能有一定背景，咨询抗体供应商选择与其一致的封闭剂吧。
一抗孵育。抗体本身的质量是WB中最最最重要的因素，这个我们单独再谈。一般4℃过夜孵育的效果会更好，采用5%的TBST-BSA稀释抗体是不错的选择。回收再使用别忘了NaN3。
二抗孵育就不多说了。注意各种标记二抗的标记物的区别，选购时要结合效价来比较每次实验的单价，这样才能买到性价比最高的二抗，ABclonal是很好的选择。批量购买的话，一定要保证批次间无差异，ABclonal相关产品出库前可是会严格质控的。
显影底物也得提一下。市面上各种底物之间的灵敏度差异真的很大!高灵敏度的底物能很好的减少一抗的使用量。
好了，操作方法介绍到这，下面我们一起来观摩一下
WB操作不当案例分析
A：封闭不完全；抗体或血清非特异结合；
B：转膜未转完全、抗体效价过低或目的蛋白丰度过低（导致信号弱、部分信号、条带不完
整），以及转膜不当造成气泡（转膜过程中，凝胶和膜没有充分贴合，出现空泡现象。检测结果中此区域的信号会较弱，影响结果判定）；
C：蛋白样本降解（蛋白样本降解后，检测到弥散或多条带）；
D：封闭液中脱脂奶粉未完全溶解，溶液中的颗粒吸附在膜表面，颗粒占据的位置就没有封闭完全，检测结果中就会出现斑斑点点。
E：样本上样量过大或抗体稀释度过小，检测结果中，条带连成一片。
F：制备凝胶不均匀（在不均匀的位置，检测的条带形状会出现变形）；部分信号淬灭（可能膜放较长时间）导致曝光不好；
G：样品浓度太高；电压不稳或凝胶在电泳过程中过热，出现条带变形；
以上为一些常见的WB问题解析，是不是有似曾相识的赶脚，希望对苦苦挣扎中的你有所帮助。
说到这似乎要结束了，不急，后面还有干货。
话说WB操作好比西天取经，一路历经艰辛，仿佛不遇到点幺蛾子，就不算做过一次WB实验。吃瓜群众不禁要问，世界在进步，科学在发展，有没有简单快捷的方式，过程越多，出错的概率就越大。
当然有，WB一步法。
常规的Western Blot检测过程（封闭，洗涤，一抗结合, 洗涤，二抗结合和洗涤）需要5-6个小时（一抗过夜需要时间更久），实验流程复杂且需要多步条件优化，使用一步法抗体可以在不减弱实验灵敏度的情况下，将封闭，洗涤，一抗结合, 洗涤，二抗结合合并为一个步骤，把实验时间锐减为2小时左右。胶上的蛋白转移到印迹膜上后，使用一抗和二抗稀释而成的抗体孵育液短时间孵育印迹膜后，经简单洗涤，即可进行发光或显色检测。
常规WB与新型一步法WB操作示意图
除了省时省力外，新型一步法快速WB实验有检测灵敏度高和背景低等多种优点。当然这些诸多优势也不是没有限制的，自然对抗体提出了更高的需求，特异型好自不必说，且效价要高，毕竟要在短时间内发生亲和反应。
一步法抗体结果展示
RK05658 [one step] HSP90AA1 Antibody Kit
RK05713 [one step] TARDBP Antibody Kit
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