蛋白质磷酸化(Proteinphosphorylation)是生物界最普遍，也是最重要的一种蛋白质翻译后修饰(Posttranslationalmodifications，PTMs)，20世纪50年代以来一直被生物学家看作是一种动态的生物调节过程。在细胞中，大约有1/3的蛋白质被认为是经过磷酸化修饰的[1]。在人类基因组中，大约有2%的基因编码了500种激酶和100种磷酸酶[2]。蛋白质磷酸化和去磷酸化是原核和真核生物细胞表达调控的关键环节，对许多生物的细胞功能起开关调控作用，是一种普遍的重要调节机制。因此，蛋白质磷酸化的分析和磷酸化位点的鉴定已成为目前蛋白质组学研究的热点之一。 磷酸化蛋白质根据其磷酸氨基酸残基的不同大致可分为四类，即:O-磷酸盐、N-磷酸盐、酰基磷酸盐和S-磷酸盐。O-磷酸盐是通过羟氨基酸的磷酸化形成的，如丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸，羟脯氨酸或羟赖氨酸磷酸化仍不清楚；N-磷酸盐是通过精氨酸、赖氨酸或组氨酸的磷酸化形成的；酰基磷酸盐是通过天冬氨酸或谷氨酸的磷酸化形成；而S-磷酸盐通过半胱氨酸磷酸化形成。 (1)磷酸化参与酶作用机制，在此过程磷酸化为反应性中间产物(多为S-或N-磷酸盐)，如在磷酸烯醇型丙酮酸羧激酶依赖的磷酸转移酶系统(PTR)的组氨酸蛋白激酶(HPr)；
(2)磷酸化介导蛋白活性，蛋白分子通过蛋白激酶发生磷酸化，如蛋白激酶A(丝氨酸和苏氨酸残基)或不同的受体酪氨酸激酶(酪氨酸残基)；
(3)天冬氨酸、谷氨酸和组氨酸的磷酸化在细菌趋化反应的感觉性传导中发生解离。 蛋白质的磷酸化和去磷酸化过程调节着细胞信号转导、细胞分化和细胞生长等几乎所有的生命活动过程，因此，被生动形象的描述为细胞生理活动的分子开关。蛋白质在蛋白激酶作用下发生磷酸化，在磷酸酶的作用下去磷酸化。不同的蛋白激酶可识别和修饰不同蛋白质的不同位点。这就扩大了磷酸化蛋白质研究的复杂性，从而使磷酸化蛋白质成为蛋白质翻译后修饰研究的热点。

大量实验表明:改变生物的生长环境，可诱导出生物体内的蛋白质磷酸化现象的发生，从而导致细胞内蛋白质的组成和数量发生变化，最终使生物体的生理状态发生改变。因此，当细胞中的蛋白激酶或磷酸酶的活性受到抑制或过表达时，蛋白质磷酸化过程就会紊乱，从而导致细胞周期调控异常。因此，肿瘤的形成与蛋白质的磷酸化异常有很大相关性。换句话说，蛋白质磷酸化的分子机制对于癌症等重大疾病的研究具有相当的指导意义。这也就使其当之无愧地成为了生物学研究领域中的热点。
[ 1 ] Zolnierowicz S , Bollen M. protein phosphorylation and protein phosphatases [J ] . De Panne , Belgium , 1999 , Sep , 12 - 24.EMBO J , 2000 ,19 :483 - 488.
[ 2 ] Mann M, Ong S E , Gronborg M, et al. Analysis of protein phosphorylation using mass Spectrometry : deciphering the phosphoproteome[J ] . Trends Biotechnol , 2002 ,20 :261 - 268.
  1、初来乍到，小编能分享一下如何鉴定蛋白的磷酸化位点？具体而言就是常用的软件有哪些？通过哪些实验能比较容易的确定这些磷酸化位点？

回答：
对于蛋白修饰性位点的预测还是有很多网站的，首先我们看看常用查询蛋白信息的数据库：
Uniprot：http://www.uniprot.org/
UniProt 是 versal ein 的英文缩写，是信息最丰富、资源最广的蛋白质数据库。它由整合Swiss-Prot、 TrEMBL 和 PIR-PSD 三大数据库的数据而成。他的数据主要来自于基因组测序项目完成后，后续获得的蛋白质序列。它包含了大量来自文献的蛋白质的生物功能的信息。 1.确定样本中磷酸化蛋白的表达量？
答：对的样本，正确的处理方法和合适的阳性对照是实验成功的第一步。
对的样本：实验前需先查阅文献或通过预实验检测该样本是否表达，若该样本根本就不表达目的蛋白，那就不要浪费感情了吧；
正确的处理方法：若正常情况下样本的磷酸化水平过低或不表达，可通过物理或化学方法进行一定的刺激和诱导，刺激条件各不相同。但这并不代表刺激越多越好，充分但不过分（如磷酸化IRS1，仅需刺激5min，刺激过久会进入负反馈机制进而开始降解）的正确刺激会帮助得到最佳实验结果；
合适的阳性对照：在任何实验中，我们都应考虑包含适当的阳性和阴性对照，可使您进一步确定抗体检测到的特异性信号。

2.总蛋白和内参对照都要做？
答：普通的内参如Actin、GAPDH等和总蛋白抗体的对照都要做吗？对，都要做！普通内参可以作为体系的对照，保证上样量一致从而排除体系本身的影响，对于结果分析比对十分重要。
同时，总蛋白抗体也必不可少，仅仅是检测到磷酸化蛋白表达量的增加并不能说明问题，只有磷酸化蛋白与总蛋白比值增加了才能说明磷酸化水平增加，这种表述实验结果的方法是最客观的，也是必需的。

3.确保完全裂解并使用新鲜样本。
答：相对于仅用裂解缓冲液裂解，裂解液裂解+超声处理可确保整个细胞充分裂解并打断染色质DNA。建议在35%-40%的功率输出条件下超声3次，每次10s。由于不同仪器不同性能，请根据生产商的建议进行优化。
超声处理时应保持低温，冰上操作。如果您没有探头超声仪，用细的注射器针头反复吹打也能起到类似的作用。在得到样品后，请不要反复冻融，建议-80℃冰箱分装保存。

4.小心蛋白杀手。
答：组织或细胞裂解时会释放出大量内源性蛋白磷酸酶，它可以催化磷酸化蛋白的去磷酸化，导致不同于正常生理状态的差异。因此，在lysis buffer中加入蛋白酶抑制剂和蛋白磷酸酶抑制剂，抑制磷酸化蛋白的去磷酸化，维护蛋白质的磷酸化状态，非常重要。否则条带很浅不说，结果可信度还不能保证。
注意：使用PMSF时要新鲜配置。

5.样品低温处理。
答：除超声时保持低温，在做磷酸化蛋白的整个实验过程中都要保证低温环境。磷酸化蛋白在室温条件下很容易被蛋白磷酸酶降解，即便加入磷酸酶抑制剂也很明显。所以务必要保持！低温！环境！

6.用5%脱脂牛奶的TBST室温封闭1h。
答：网络上流传的磷酸化抗体不适于用牛奶封闭的说法是没有科学依据的。这一误区的出现可能是由于实验者使用了非实验级奶粉引起的（国内许多奶粉含有磷酸酶等杂质）。ABclonal建议转膜后迅速在TBS中洗涤膜几秒，以便移除残留的转膜缓冲液，随后使用5%脱脂牛奶（请使用实验级）的TBST室温封闭1h，这一封闭步骤有助于降低非特异性一抗结合并降低背景。另外应避免膜封闭时间过长，因为这会掩盖抗原表位，阻止抗体结合。ABclonal建议所有抗体均应如此。ABclonal科学家生产验证每一支上市的抗体的每一种应用，显然更懂得如何让抗体表现出最佳的状态。封闭完后，孵育一抗前最好在TBST中洗涤5min。

7.磷酸化和总蛋白抗体到底怎么孵育？
答：一般磷酸化和总蛋白的条带位置基本是一样的，所以如果样品比较珍贵或有限的情况下，可以在压完磷酸化抗体后，将膜strip后再压总蛋白抗体，stripping的时候注意温度尽量控制在50℃以内。不过ABclonal的做法是建议在样品充足的情况下同时跑两块胶，比strip效果会更好。

8.4℃条件过夜孵育一抗。
答：抗原抗体之间是一种非共价的结合，蛋白抗原在膜上靠的是物理吸附抗体，这种物理吸附在高温下会变弱，容易脱落，因此，首先保证4℃抗体孵育条件非常重要。其次要保证抗原和抗体相互磨合孵育的时间，磷酸化蛋白只占总量的极少部分，过夜可保证充分结合进而曝出更漂亮的条带。哪怕不是磷酸化蛋白，ABclonal也推荐4℃过夜孵育，让结果呈现最好的一面。（关注ABclonal微信公众号在“磷酸化蛋白进阶版2.0”文章下留言集赞前三名可免费获得50ul磷酸化抗体一支）