拮抗泛素化的人Piwi基因突变，通过阻止精子变形过程中鱼精蛋白对组蛋白的置换，导致男性不育。

基本信息
题目：Ubiquitination-deficient Mutations in Human Piwi Cause Male Infertility by Impairing Histone-to-Protamine Exchange during Spermiogenesis
期刊：Cell
影响因子：31.398
客户单位：中国科学院生物化学与细胞生物学研究
ABclonal合作技术：MIWI蛋白表达及抗体定制，适用于WB、IF、RIP 
研究背景
近年来，随着全球人口出生率持续缓慢增长及人口老龄化加剧，不孕不育已逐渐由单纯的医学问题演变为备受关注的社会问题。据不完全统计，在我国的不孕不育夫妇中，男性因素约占50%，非梗阻性无精、弱精及精子畸形是造成男性不育的重要原因，但其致病原因及机制还不甚了解，导致临床诊断和治疗策略极其有限。
分子机制：Piwi基因特异性地在动物生殖系细胞中表达。在高等动物中， Piwi则主要在雄性生殖细胞中表达。拮抗PIWI蛋白泛素化的D-box基因突变，使PIWI蛋白不能在精子变形后期被正常清除，导致启动组蛋白-鱼精蛋白交换的组蛋白泛素连接酶RNF8不能入核，进而阻止后期精子细胞中鱼精蛋白对组蛋白的置换，最终导致精子数量剧烈减少、精子功能异常和男性不育。
1.首先对413例无精症患者（300例健康人群作为对照）Piwi（Hiwi）基因上十分保守的D-Box序列进行测序，发现3例无精症患者身上存在PiwiD-Box突变。实验检测发现这类突变导致了Piwi蛋白泛素化缺陷，但是不影响PIWI对靶RNA分子的切割作用以及piRNA-loading的功能  
   Identification of D-Box Mutations in hiwi Genes from Patients with Azoospermia

2.为了进一步验证PiwiD-Box突变是否可以导致男性不育症的发生，进行了小鼠模型实验，PiwiD-Box突变knock-in突变后，小鼠出现雄性不育、精子形态异常以及细胞核结构疏松。       Spermiogenesis Is Defective in Miwi^+/DB-Cre Mice

3.精子发育在结构特化的过程中会发生“组蛋白-鱼精蛋白转换（Histone-to-Protamine exchange）。结合客户在2013年在Dev Cell杂志上的文章， piRNA通过泛素-蛋白酶小体途径调控其结合蛋白MIWI及自身的降解代谢，揭示了PIWI/piRNA的代谢调控机制以及piRNA调控泛素化途径的新功能。基于上述研究背景，作者对小鼠精子中组蛋白泛素化修饰进行了检测。
4.PiwiD-Box knock-in小鼠的后期精子细胞中组蛋白泛素化水平显著下降，且H2B泛素化水平大幅下降。MIWI（PIWI）与RNF8相互作用，抑制了RNF8入核泛素化组蛋白。D-Box突变导致MIWI突变体蛋白在细胞质中的累积，而且抑制了RNF8泛素连接酶入核，从而影响精子发生过程中组蛋白的泛素化以及进一步的“组蛋白-鱼精蛋白置换”过程。进一步实验表明RNF8-N（N端1-210aa）可以竞争RNF8全长蛋白和MIWI的结合作用。有趣的是，在PiwiD-Box突变的精子中过表达RNF8-N可以恢复精子的活力。这一策略可用于治疗这类无精症/少弱精症。
5. RNF8和MIWI互作结构域的确认，将RNF8分段表达，使用coIP实验验证RNF8和MIWI结合结构域位于RNF8的N端。 RNF8 Binds to MIWI via Its 68QNPEG72 Motif in N-Terminal Domain

6.MIWI IP验证MIWI泛素化实验，RIP验证实验MIWI和piRNAs关系。   Ub-MIWI conjugates were dramatically reduced in late spermatids isolated from Miwi ^+/DB-Cre mice
   RNA co-IP assays of MIWI associated-piRNAs (top) in Miwi+/DB and Miwi+/DB-Cre testes


文章小结
该项研究工作是一项从人类遗传学到动物模型、分子机理及至治疗策略探索的系统研究。首次证明Piwi基因突变可致男性不育，并为这类不育症的早期分子诊断及临床治疗提供了理论依据和方法策略。

解析文献
Ubiquitination-deficient Mutations in Human Piwi Cause Male Infertility by Impairing Histone-to-Protamine Exchange during Spermiogenesis

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